机械法分离叶绿体
一、原理
研磨叶片得到的匀浆，经过滤、离心可制备叶绿体。叶绿体的被膜比较脆弱，分离叶绿体应在等渗的缓冲溶液中，0~4℃温度下进行。叶绿体活力会随着离体时间延长而不断下降，因此，分离工作尽可能在短时间内完成。
机械法分离叶绿体
二、仪器与用具
冰箱；离心机；扭力天平；显微镜；pH计；研钵；量筒；移液管；离心管；脱脂纱布等。分离器皿都须在0℃下预冷。
三、试剂
1.分离介质
含0.33mol/L山梨醇，50mmol/LTris-HCl（或Tricine）pH7.6，5mmol/LMgCl2，10mmol/LNaCl，2mmol/LEDTA，2mmol/L异抗坏血酸钠。
配法：称60g山梨醇、6.06gTris、1gMgCl2·6H2O、0.6gNaCl、0.77gEDTA-Na2、0.4g异抗坏血酸钠，溶解后用1mol/LHCl调pH至7.6，定容至1000ml。
2.悬浮和测定介质Ⅰ
0.66mol/L山梨醇，2mmol/LMgCl2，2mmol/LMnCl2，4mmol/LEDTA，10mmol/L焦磷酸钠，100mmol/LTris-HClpH7.6。
配法：称60g山梨醇、0.2gMgCl2·6H2O、0.2gMnCl2·4H2O、0.75gEDTANa2、2.23gNa4P2O7·10H2O、6.06gTris，溶解后用1mol/LHCl调pH至7.6，定容至500ml。
3.悬浮和测定介质Ⅱ
测定介质Ⅰ稀释1倍。
四、方法
1.选用生长健壮，最好是连续几个晴天下生长的菠菜叶片，洗净后去除中脉，放入0~4℃冰箱或冰瓶中预冷。
2.分离介质30~50ml，置于研钵中，并在冰箱中预冷至现薄冰。
3.取冷却的菠菜叶片10~20g，撕碎后放入研钵，用手工快速研磨0.30~1min，注意不要用力过猛，也不必研磨过细，以叶片磨成小块时即可，研磨后将匀浆用两层新纱布过滤。
4.将滤液装入预冷过的二个离心管，经天平平衡后，用离心机以1000r/min离心2min。
5.倾去上层液，沉淀即为叶绿体。随后每管加2ml悬浮和测定介质Ⅱ，并用吸管冲散沉淀。叶绿体悬浮液合并后放冰瓶中备用。
6.用滴管吸取少量叶绿体，加少量悬浮和测定介质Ⅱ稀释，置显微镜（400~600倍）下，观察叶绿体的形态。
上述是机械法从叶片中分离叶绿体，此外也可从原生质体中分离高活性的叶绿体，具体方法可参照《生物生产力和光合作用测定技术》（科学出版社，1986）一书
机械法分离叶绿体