分离度随柱长平方根的增加而增加，但分析时间却随柱长增加而呈线性增加。因此在达到一定分离度的条件下应尽可能使用短柱，一般填充柱柱长为1-5m。计算柱长的简便方法是先选择一个极性适宜的任意长度的色谱柱，测定分离度，而后确定柱长是否适宜。
柱长的选择与固定相及柱温比较，居次要地位。在分离度距离要求相差不多时，降低柱温常可达到目的，否则再增加柱长或更换固定相。
色谱柱的内径增加会使柱效下降，一般柱内径为2-6mm。