柱温是一个重要的操作参数，而且柱温的变化对不同组分的影响程度不是等效的。若有两类化合物在某一柱温下不能分离，当柱温改变20℃，就有可能完全分离。柱温主要影响分配系数、分配比、组分在流动相中的扩散系数和在固定相中的扩散系数，从而通过影响柱选择性、柱效来影响分离度和分析时间。
选择柱温首先要考虑到每种固定液都有一定的使用温度。柱温不能高于固定液的最高使用温度，否则固定液挥发流失。
柱温对组分分离的影响较大，提高柱温使柱选择性降低，不利于分离，所以从分离的角度考虑，宜采用较低的柱温;但柱温太低被测组分在两相中的扩散速率大为减少，分配不能迅速达到平衡，峰形变宽而柱效下降，并延长分析时间。
柱温选择的原则是：在使最难分离的组分有尽可能好的分离前提下，尽可能采取较低的柱温，但以保留时间适宜，峰形不拖尾为度。具体操作条件的选择应根据样品的性质确定。
对于高沸点(300-400℃)化合物，受固定液使用温度的限制，希望在较低的柱温下分析，一般低于其沸点100-200℃。为了改善液相传质速率，可用低固定液配比(1%-3%)的色谱柱，使液膜薄一些，液相传质阻力小一些。这时柱容量较低，允许最大进样量将减小，因此应采用高灵敏度检测器。对于沸点不太高(200-300℃)的混合物，可在中等柱温下操作，柱温比其平均沸点低100℃，固定液含量5%-10%。对于沸点在100-200℃的混合物，柱温可选在其平均沸点的2/3左右处，固定液含量10%-15%。对于气体、气态烃等低沸点混合物，柱温选在其沸点或沸点以上，以便能在室温或50℃以下分析;固定液含量一般在15%-25%。
对于沸点范围较宽的试样，宜采用程序升温，即柱温按预定的加热速率，随时间作线性或非线性的增加。升温的速率一般常是呈线性的，即单位时间内温度上升的速率是恒定的。在较低的初始温度，沸点较低的组分(即最早流出的峰)可以得到良好的分离。随柱温增加，较高沸点的组分也能较快地流出，并和低沸点组分一样也能得到分离良好的尖峰。