免疫分子生物技术制作步骤？
免疫分子生物技术
简介：
人体内的细胞遇抗原时,会受刺激繁殖,而产生大量有专一性的抗体(monoclonalantibody).而抗元常引起不同的B细胞产生抗体,故在血液中的抗体实际上是多元性抗体(polyclonalantibodies),其原因是此抗元常含有不只一处致抗体的部位(epitopes),每个部位都可引起一个不同B细胞抗体.
抗体有五种,IgG,IgA,IgD,IgE及IgM,对同一个人而言,此5种抗体均对同一抗元有作用.抗体的形状如Y字形,有二条轻鍊,二条重鍊.轻鍊又有K和λ二种,(但同一抗体只含其一),但重鍊则只有一种.即IgG是γ,IgA是α,IgD是δ,IgM是μ,IgE是ε.
不论轻,重鍊均含有变异端(variableregion)与恆常端(constantregion),与抗元作用的部分是在轻,重鍊变异端的高度变异(hypervariableregion)部分,大约站15Å×20Å×15Å的空间大小.
抗体之所以能有如此多变化,并非人的基因有如此大量,而是在B细胞成熟过程中,其基因重组(有很多恆常端,变异端,连接端,变化diversity端的基因,可以重组排列),可以构成不同的抗体.
将酶衔接至抗体之技术
将酶衔接至抗体上,是使酶(例如horweradishperoxidaseHRPO,或alkalinephosphatase)与抗体形成稳定的.且不影响酶与抗体之功能.
以HRPO衔接为例,其化学变化如下：
此一技术,可用于Enzyme-linkedimmounoworbentassay(ELISA)及westernboltting,其方法如下：
材料：
1mg/mlantibodysolution
0.1Mphosphatebuffer,pH6.8
Horseradishperoxidase(HRPO)
0.1MCarbonatebuffer,pH9.2
Sodiumperiodate(NaIO4)solution,freshlyprepared
Sodiumborohydride(NaBH4)solution,freshlyprepared
Saturatedammoniumsulfate(NH4)2SO4solution
Tris/EDTA/NaCl(TEN)buffer,pH7.2
BSA
Glycerol
Dialysismembrane
Pasteurpipetfittedwithglasswool
SephadexG-25,medium
方法：
1.将1mg/ml抗体以2公升0.1MphosphatebufferpH6.8透析,过夜,4℃缓缓搅拌.(抗体量可以A280/1.44＝mgIg/ml来计算)(透析膜影50﹪ethanol浸一小时,再以10mMNaHCO3浸一小时,再以1mMEDTA浸一小时,再以dH2O冲洗,再保存在phosphaedbuffer中,4℃,为防细菌生长,buffer中可加入0.01﹪的sodiumazide).
2.溶10mg的GRPO于1ml的0.1Mcarbonatebuffer,pH9.2中.
3.将0.25ml新配好的NaIO4液与0.25ml的10mg/mlHRPO/carbonate液溷合,盖紧盖子,置室温2hr(避免光照).
4.在一支Pasteurpipette中放入适量glasswool,将出口处以parafilm包好,再将1ml以透析过的antibody液,加入0.5ml的10mg/mlHRPO液中,再将0.25g的SephadexG-25加入此antebody/HRPO溷合液中(此一步骤可增进酶与抗体之结合).将此溷合物加入此Pasteurpipette中.
5.置于暗室,室温3hr.
6.将此Column以0.75ml的Carbonatebuffer将conjugate洗出,保存.
7.在此释出液中,加入38μl的新配好之NaBH4液,在室温,暗室,置30min.
8.再加入112μl的NaBH4液,暗室,置60min.
9.再加入饱和0.9ml(NH4)2SO4液,缓缓搅拌30min,4℃,离心15min,10,000xg.
10.倒去上清,将沉淀物溶于0.75ml的TEN中.
11.透析此液,4℃,2公升的TEN,过夜,第二天换过一次TEN液,再透析4hr.
12.将透析膜内物取出,加入适量BSA,使此液中最终BSA量为20mgBSA/ml.
13.加入等量之glycerol并保存在-20℃.
配方：
0.1MCarbonatebuffer,pH9.2：
1.36gSodiumcarbonate
7.35gSodiumbicarbonate
950mlH2O
以1MHCl或1M的NaOH调整pH至9.2再加dH2O使体积成为1公升.
0.1Mphosphatebuffer,pH6.8：
保存A溶液：0.2M：31.2gNaH2PO4于1公升的dH2O中
保存B溶液：0.2M：28.39gNaH2PO4于1公升的dH2O中
溷合51ml的A液与49ml的B液,及100ml的dH2O成为使用溶液.
饱和ammoniumsulfate(NH4)2SO4液：
将1.21gTrisbase加入990mldH2O中,使成0.01MTris液,调整pH至7.0,再加dH2O,使总体积为1公升,量767g的(NH4)2SO4加入此Tris液中,搅拌,并加为热,使溶,调整pH至7.0,并保存在4℃,(NH4)2SO4的结晶会沉淀出来.
Sodiumborohydride(NaBH4)液：
5mgNaBH4/mldH2O,必须用前才配
Sodiumperiodate(NaIO4)液：
1.71mgNaIO4/mldH2O(用前才配)
Tris/EDTA/NaCl(TEN)液,pH7.2：
在930mldH2O中加入：
0.06gTrisbase
0.37gNa2EDTA
8.77gNaCl
调整pH至7.2(以HCl滴定)
加dH2O使体积成为1公升
附注：
1.使用此法,约1ng/ml至10ng/ml的抗元可以侦测到.
2.在使用时,可将结果稀释100至10,000倍.是效果如何而定.
准备细菌抗元
材料：
E.Coli(长于培养液中)
Cellresuspendingbuffer
Lysozymesolution
Tris/EDTA/NaCl(TEN)buffer
10﹪SDS
8Murea
方法：
1.将5ml的E.Coli液在桌面离心机离心2,500rpm,10min,倒去上清,将沉淀细菌溶于5mlresuspendingbuffer中,充分溷合(Votex).
2.吸出1ml细菌液入1.5ml的微量离心管中,置冰上再加入0.2ml的lysozyme液,待5min.
3.离心3,000rpm,5min,保留上层,将沉淀物以1.2mlTEN溶解之.(因为有些蛋白质是不溶于水,故二者均应保留)
4.在每一种样本中各加入65μl的10﹪SDS,置37℃,10min,此时样本即可使用,若不使用应冷冻保存,若有必要可以8Murea液(4.8gurea加入10ml液中),处理蛋白质.
配方：
cellresuspendingbuffer(10mMHEPES)
2.38gHEPES
加dH2O或1liter
附注：
1.在免疫学实验中,Enzyme-LinkedImmunolorbentAssays(ELISA)是常用于侦测细菌或抗元的方法.一般分为直接法,即将抗元放入microtiterplate,使附着在内壁,再以dilutingbuffer使未被附着处能不接受抗体附着,接者加入已衔接酶的抗体,再洗去多馀的抗体,再加入酶的作用物,使产生反应.
另一种为间接法,即先将抗体放入microtiterplate中,使与内壁附着,再以diluitngbuffer处理,使未被附着的壁不会接受抗元,再加入抗原始与抗体作用,再洗去多馀的抗体,再加入已衔接酶的抗元,再洗去多馀的,再加入酶的作用物使产生反应.
直接法的缺点是想测的有专一性的抗元须与其他杂质互争附于内壁,以致有时量少,而间接法则可选择性的留下受测的抗元.
2.至于抗体,可以用抗元配合adjuvat一同注射入体中,4週后再增强注射一次,2週后再增强一次,以后每次抽血前7天注射一次即可取得含此抗体的血液.此血液经离心,保存血清,再以ammoniumsulfate沉淀抗体(约33﹪的浓度即可沉淀出IgG),再离心,保存沉淀物,再透析去盐,即可得抗体