细胞培养和转染
细胞培养和转染
1.细胞培养(HEK293T)
1)显微镜下观察细胞，细胞生长状态良好，去上清；
2)加入预热的PBS3ml,温柔地清洗细胞,弃去PBS；
3)用胰蛋白酶消化细胞，通常75cm2培养瓶的贴壁细胞用3ml胰蛋白酶于37oC
处理5min；
4)待细胞脱落后，加入5mlDMEM培养液(含10%FBS)以终止消化反应，并将
细胞悬液转移入15ml或50ml离心管中；
5)1000rpm离心5min，去除上清；
6)加入10mlDMEM培养液(含10%FBS)，重新悬浮细胞，使细胞充分打散；
7)进行细胞计数,(4个大方格细胞数的均值×104个为每ml所含细胞数)；
8)根据细胞计数结果，将适当数量的细胞悬液转接入含有新鲜培养液的培养瓶
或皿中；(第二天做转染，A.Fugene6法--细胞总量应达4-5×106/10cm培养
皿;B.磷酸钙法:细胞总量应达3×106/10cm培养皿)；
9)置于37℃5％CO2的培养箱中培养(注意培养箱应有足够的水分)。
注：以上所使用的胰蛋白酶、培养液等在使用前都置于37℃水浴中预热，以减
小对细胞的刺激。
2.细胞转染
2.1脂质体介导的贴壁细胞转染法
以下针对293T细胞、10cm培养皿
目前主要使用试剂盒为Roche公司的FuGENETM6TransfectionReagent
1)转染前24小时以4-5×106/10cm培养皿的细胞总量铺板，当细胞生长状态
第三章细胞培养和转染
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良好且贴壁细胞密度达到50~80%时即可进行转染；
2)在1.5ml离心管中加入需要共转的2种质粒DNA各5μg，混匀。
3)将50μlFuGENE6脂质体加入500μlDMEM(serumfree)培养液(注意不要
将FuGENE6脂质体沾到管壁)，加入前述DNA，轻轻混匀，RT培养30分
钟；
4)将含有DNA和脂质体的液体小心加入到培养皿中，分散均匀，置于37℃5
％CO2的培养箱中培养24－48小时。
2.2磷酸钙介导的贴壁细胞转染法