重组人胰岛素的制备—下游纯化工艺的研究
摘要建立了一套通过大肠杆菌表达(His)6
2Arg2Arg2人胰岛素原制备重组人胰岛素的工艺。将大肠杆菌中以包涵体形式表达的RRhPI依次经过DEAE2琼脂糖快流速阴离子交换层析,SephadexG225层析,重组复性酶切转化和Superdex75分子筛,制备重组人胰岛素。SDS2PAGE、HPLC、氨基酸组成分析和小鼠惊厥实验结果证明,制备的重组人胰岛素具有天然生物活性,而且纯度较高。
关键词重组人胰岛素纯化DEAE2琼脂糖快流速阴离子交换剂Superdex75
1引言
分离纯化是基因工程药物生产中极其重要的一环,这是由于工程菌经过大规模培养后,产生的有效成分含量很低,杂质含量却很高;另外由于基因工程药物是从转化细胞,而不是从正常细胞生产的,因此对产品的纯度要求也高于传统产品。所以要得到合乎医用要求的基因工程药物,分离纯化要比传统产品困难得多。在重组人胰岛素(Recombinanthumaninsulin,rhI)的基因工程生产中,同样面临着下游处理非常复杂的问题。为了能有效地纯化目的产物,目前基因工程生产中普遍使用的是亲合层析和HPLC等手段,这些分离纯化技术虽然分辨率高,特异性强,但十分昂贵。不利于降低成本。为了降低生产成本,本研究建立了一套由(His)62Arg2Arg2人胰岛素原制备重组人胰岛素的下游纯化工艺,并对产品的性质和纯度进行了鉴定。
2材料与方法
2.1工程菌
RRhPIöpQE240大肠杆菌M15菌株。
2.2主要试剂
DEAE2琼脂糖快流速阴离子交换剂,Sephadex,Superdex75,胰蛋白酶和羧肽酶B,低分子量蛋白,人胰岛素,谷胱甘肽(氧化型和还原型),DTT,其它化学试剂均为国产或进口飞行纯。
2.3RRhPI的初步纯化
DEAE2琼脂糖快流速阴离子交换层析柱用30mmolöLTris2HCl,8molöL尿素,pH8.0平衡,包涵体用30mmolöLTris2HCl,8molöL尿素,50mmolöLDTT,pH8.0溶解后上柱,用合适的氯化钠梯度进行洗脱,SDS2PAGE确定RRhPI组分,收集含RRhPI的洗脱液。2.6复性及酶切转化将初步纯化后的RRhPI在SephadexG225层析柱上脱尿素,转换缓冲液进行重组复性,然后用胰蛋白酶和羧肽酶B协同酶切将RRhPI转化为人胰岛素(Humaninsulin,hI),0.1molöLZnCl2终止反应并沉淀hI。
2.4hI的纯化
将hI粗品用30mmolöLTris2HCl,8molöL尿素,pH8.0溶解,在Superdex75上进行分离纯化。层析柱的平衡液和洗脱液均为0.2molöL乙酸钠2乙酸,pH4.0。
2.5HPLC分析
在HPLC仪上,用ODSC18反相柱(150mm×6.0mm)进行分析,流动相为0.2molöL(NH4)2SO4溶液(1molöLH3PO4调pH至3.5)和50%乙腈水溶液按1∶1(vöv)混合而成,流速1.0mlömin,检测波长214nm,上样量20ul。
2.10氨基酸组成分析
称样品2.5mg,加6molöLHCl2ml,110℃水解24h,蒸干后加入2ml无离子水溶解,直接进样,在氨基酸分析仪上进行氨基酸组成分析。
2.11hI整体生物活性的鉴定
按2000版《中华人民共和国药典》的规定用小白鼠惊厥法鉴定hI的整体活性。
3结果
3.1RRhPI的初步纯化
层析图谱见图1,RRhPI主要集中在峰2。收集峰2,进行SDS2PAGE分析,见图2。结果显示电泳条带主要集中在13KD附近,峰1为穿透峰,此峰中含有pI高于8.0的和一些疏水性的蛋白质,而绝大部分pI低于RRhPI的蛋白质和核酸类杂质牢固地结合在柱子上,需要较高的盐浓度才能洗脱下来。
表1是6次层析的重复实验结果,可以看出,RRhPI的回收率较高,稳定在75%～80%左右。
表1离子交换层析的RRhPI回收率
Table1RRhPIrecoveryofDEAE-SepharroseFastFlowionexchangechromatography
Testnumber(n=6)RRhPIrecovery(%)
175.2
277.0
375.5
478.2
579.6
679.8
x±s77.55±1.81
3.2复性及重折叠
经过初步纯化的RRhPI通过SephadexG225柱层析脱尿素并转换缓冲液为50mmolöL甘氨酸2NaOH,pH9.5。层析图谱(见图3),有2个层析峰,峰2主要为折叠趋于正确的单体RRhPI,收集峰2。进行SDS2PAGE分析。结果(见图2)显示,收集的RRhPI样品中高分子量杂蛋白的含量有所减少。峰1为高分子量杂蛋白和RRhPI的二聚体或多聚体及折叠不完全或不正确的RRhPI。
3.3RRhPI酶切转化hI
在收集的RRhPI单体组分中,加入2.5mmolöL还原型谷胱甘肽和0.25mmolöL氧化型谷胱甘肽以控制2SH比例,通过二硫键的交换形成稳定的具有天然结构的RRhPI。在37℃条件下,用胰蛋白酶(1ö500,酶öRRhPI底物)和羧肽酶B(1ö1000,酶öRRhPI底物)协同酶切30～40min,(His)62Arg2Arg和C肽被准确切除,RRhPI转化为hI。SDS2PAGE结果表明,RRhPI几乎被完全酶切转化为hI,主要电泳条带的位置从13KD附近下移至与人胰岛素标准品平行的位置,见图2。
3.4hI的纯化
用0.1molöLZnCl2沉淀的hI粗产品可通过Superdex75进行纯层析图谱见图4,hI主要集中在峰3。收集峰3进行SDS2PAGE分析,结果显示,见图2,所得hI组份在SDS2PAGE分析中是均一的,只有一条蛋白带。将峰3组分透析,浓缩并冻干,即可最终制得hI。
3.5产品的性质鉴定
3.5.1SDS2PAGE分析结果(见图2)表明,本研究得到的产品的分子量与hI标准品相同,且纯度较高,在SDS2PAGE中呈一条蛋白带。3.5.2HPLC分析本工艺制备的重组胰岛素制品主峰的保留时间(27.757min)与标准品hI的保留时间(27.968min)基本一致,而与猪胰岛素的保留时间(25.437min)有明显差别。
图4Superdex75纯化hI
Fig4GelfiltrationofhIonSuperdex75Peakaandpeakb:impurities,Peakc:hI
3.5.3氨基酸组成分析分析结果见表2,该结果表明本工艺制备的重组胰岛素样品的氨基酸组成与hI基本一致。样品中不含Met,与胰岛素原一起表达的(His)62Arg2Arg已被准确切除,样品中只剩下1个Arg和2个His,这表明RRhPI已被成功地转化成了hI。
3.5.4hI整体生物活性的鉴定5只昆明种清洁级小白鼠(雄性20～24g),按每20g体重皮下注射hI样品1.25U,注射后2h内均出现降血糖阳性反应,其中有4只惊厥。随即腹腔注射1ml5%葡萄糖注射液,惊厥现象消失。这表明本工艺制备的hI样品具有很好的降血糖活性。
4讨论
4.1RRhPI的初步纯化
为了快速准确地从大量的杂蛋白中捕获目标产品,特异性极高的亲和层析是一个理想的选择。通过专一性识别RRhPI中的6个组氨酸残基,Ni2+2NTA亲和层析可以一步纯化目标产物RRhPI。但是,Ni2+2NTA亲和介质较昂贵,势必增加生产成本,所以在实际生产中很难推广应用,只能用于表达筛选。为了降低成本,本研究选用相对便宜的DEAE2琼脂糖快流速阴离子交换层析初步纯化目标产物RRhPI。通过精心筛选层析条件,目标产物的纯化效果较好,SDS2PAGE分析结果显示,电泳条带主要集中在MW13KD左右,收率达77.5%±1.81%(n=6)。目前尚未见采用国产DEAE2琼脂糖快流速阴离子交换层析纯化重组胰岛素产品的相关报道。
4.2复性及酶切转换
以包涵体形式表达的RRhPI由于二硫键配对错误,水溶性很差,在进行DEAE2琼脂糖快流速阴离子交换层析时,为了增加RRhPI的溶解度,缓冲液中加入了大量的脲素,此时RRhPI处于变性环境中。因此,在双酶切转化之前必须首先除去尿素,使RRhPI复性。本研究用SephadexG225层析去除变性剂,可有效防止蛋白的聚集,并诱导变性蛋白RRhPI向其天然态折叠。在我们所采用的条件下进行层析,得到2个层析峰,峰2为折叠趋于正确的单体RRhPI。其中的高分之量杂蛋白有所减少。峰1为高分子量杂蛋白、多聚RRhPI及折叠不完全或不正确的RRhPI。对这一部分进行再层析和折叠反应,可以提高折叠的总收率。由此可见,此步层析可达到纯化,去除变性剂和诱导复性的三重效果。在体内,参与胰岛素原转化过程的有两种Ca2+依赖的内肽酶以及羧肽酶H。在体外,用胰蛋白酶和羧肽酶B协同酶切同样可将胰岛素原转变成胰岛素,这使得通过E.coli表达人胰岛素原制备人胰岛素成为可能。在本研究构建的表达产物中,引导肽(His)6与胰岛素原之间插入了两个Arg,这与C肽和胰岛素之间连接的方式是相同的,因此在双酶切转化的同时,(His)62Arg2Arg可以被准确去掉,不必另外采用其它的处理方式,从而减化了后处理过程。在本研究所选用的酶切条件下,RRhPI被准确有效地转变成了hI。SDS2PAGE分析显示,酶切较完全,主要电泳条带从13KD附近转移到了与人胰岛素标准品平行的位置。
4.3胰岛素纯化
目前人们普遍使用制备型HPLC进行基因工程产物的最后一步纯化。这是因为HPLC具有操作方便快捷,分辨率高,产品纯度能一次性达到临床要求等优点。但是HPLC具有对软硬件的要求较高,前期投入大,纯化量有限等等缺点,从而使生产能力受到影响。本研究在最后纯化制备人胰岛素时选用的Superdex75分子筛层析,其具有机械强度高,稳定性好,重现性好,粒度小(24～44L),分辨率高(13000platesöm),流速快(0.85～4.4mlömin,25℃),且可在低压下操作,pH范围广(3～12),分离范围广(球形蛋白,3～70KD),非特异性吸附小,负载量大,层析条件易控制等等优点,是一个非常理想的纯化基因工程产品的层析方法。用0.2molöL乙酸钠2乙酸,pH4.0的缓冲液作平衡液和
洗脱液,将hI粗品经过Superdex75柱层析后,我们得到了纯度较高的人胰岛素制品,SDS2PAGE分析样品只有一条带。目前尚未见采用Superdex75纯化基因工程产品的有关报道。胰岛素是天然生物活性物质,必须保持天然的二级结构才能发挥降血糖的生物活性。小鼠惊厥实验的阳性结果充分表明,本研究所选择的层析条件不但有效地纯化了表达产物,而且有效地防止了目标产物hI的失活变性,本研究最终制备了纯度较高的具有天然活性的基因工程人胰岛素。
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