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BSC二级生物安全柜使用方法同一级生物安全柜一样，气体也是从外部流入二级生物安全柜，通常称为进流。进流能够防止微生物操作时产生的气溶胶从安全柜前面操作窗口逃逸到实验室内。然而，它们不同于一级生物安全柜之处为，只让经HEPA过滤的(无菌的)空气流过工作台面。内置风机将空气经前面的开口引入安全柜内并进入前面的进风格栅。因此没有经过过滤器过滤的空气不会直接进入工作区，从而保护安全柜内部存放的样品和仪器不被外界空气所污染。
二级生物安全柜的一个独有特征就是由垂直层状薄片的(无定向的)HEPA过滤器过滤后，再安全柜内部形成向下流动的气流。气流不断地冲能可产生空气传播感染的安全柜内部，从而避面存放在柜体内的样品受到感染。这样的气流被称作下沉气流。
不同型号的二级生物安全柜的主要区别在于：排气的比例以及气体经过空气高压再循环的比例不同。另外，不同的二级生物安全柜具有不同的排气方式：有的安全柜将空气过滤后直接排到室内，有的是通过连接到专用通风管道上的套管或通过建筑物的排风系统排到建筑物外面。
除了以上所提及的不同之外，所有的二级生物安全柜同1级生物安全柜一样，能够保护操作人员和实验室环境免受危害。另外，二级安全柜也能够保护产品样本在微生物操作过程中免受污染。二级生物安全柜可以在一，二，三级生物安全水平的生物因子操作中使用。
二级生物安全柜的操作方法
1．操作前，要彻底了解生物安全实验室的相关知识，生物安全柜的操作规程及操作中所需设备的操作方法。
2．确认玻璃窗处于关闭位置后，打开紫外灯，对安全柜内工作空间进行灭菌。
3．灭菌结束后，关闭UV灯。
4．抬起玻璃门至正常工作位置。
5．打开外排风机。
6．打开荧光灯及内置风机。
7．检查回风格栅，使之不要被物品堵塞，注意压力指示表读数并记录每次实验时压力指示表的读数。
8．在无任何阻碍状态下，让安全柜至少工作10分钟。
9．用消毒液彻底清洗手及手臂。
10.穿上带有松紧口袖口的长袖工作褂，戴橡胶手套并套在袖口上，戴防护眼镜，如有必要的话，戴上防护面罩。
11.用70%乙醇或中性消毒液擦拭安全柜内表面，再用纯水将乙醇或中性消毒液擦拭干净，并使之干燥。
12.必须按实验程序放入实验材料，尽量将所需要的物品在正式操作前全部放入安全柜，但不要过载，不要挡住前后风口。如所放置的物品较大，可抬高玻璃窗，并按“静音”按键消除报警声音。
13．将玻璃窗恢复到正常位置。
14．放入实验材料及设备后，等2-3分钟，将工作区域内的空气尘埃清除掉。
15．保持所有的实验材料离玻璃门至少4”，对有污染的物品要尽可能放到工
作区域的后面操作。
16．要将工作区域内的污染物质与洁净物质分开放置。
17．尽量不要将污染物质放到洁净区域内。
18．在操作期间，避免随便移动材料，避免操作者的手臂在前方开口处频繁移动；尽量减少气流干扰，如要尽量避免在工作时有人进出室内或在操作者背后走动。
19．尽量不要使用明火。
20．使用适当的灭菌技术。
21．避免使用可干扰安全柜内气流流动的装置和程序。
22．在操作过程中，如果有物质溢出或液体溅出，在将物品移出安全柜前，
一定要对其表面进行消毒，为防止安全柜内有任何残留的污染物，在安全柜工作过程中，就要将安全柜内表面全部消毒。
23．全部工作结束后，让安全柜在无任何阻碍的情况下继续至少工作5分钟，以清除工作区域内浮沉污染。
24．所有接触了污染材料的物体，在从安全柜中取出前，要进行表面消毒。
25.所有开口容器，从安全柜中拿出前要盖好。
26.用70%的乙醇或适当的中性消毒剂，擦拭安全柜内表面，再用纯水将乙醇或中性消毒液擦拭干净，并使之干燥。
27．关闭荧光灯和安全柜风机。
28．关闭外排风机。
29．关闭玻璃门，打开UV灯消毒。
30．灭菌结束后，关闭UV灯。
31．定期抬起工作区域下面板，擦拭或冲洗工作面底下空间。