代做实验Rnai慢病毒包装技术服务一、Rnai慢病毒包装意义近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(PTGS)被称为RNA干扰（RNAi）。通过构建RNAi表达载体制备shRNA(发卡结构小干扰RNA)，已成为进行RNA干扰实验的常用手段之一。而目前为了感染原代细胞和难感染的细胞系或者在动物水平进行RNAi，研究科学家更多的选择了慢病毒载体。在RNAi的研究中，为了感染原代细胞和难感染的细胞系，科学家开始借助于病毒载体实现RNAi；由于慢病毒可以同时感染分裂和非分裂细胞、整合性以及免疫原性低等优点，目前在RNAi的研究中，基于慢病毒构建的shRNA被最广泛的使用。二、Rnai慢病毒包装原理慢病毒是逆转录病毒的一种，具有逆转录病毒的基本结构，但也有不同于逆转录病毒的组分，作为基因治疗载体发展起来，最近已经用于转基因动物制备。利用慢病毒构建的shRNA/miRNA载体与化学合成siRNA和基于瞬时表达载体构建的shRNA相比。一方面可以扩增瞬时表达的载体使用，另一方面，lentivirus-shRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞，悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组在，进行长时间的稳定表达。三、Rnai慢病毒包装实验步骤下面以转染60mm培养皿为例进行说明：第一：种植细胞，在60mm培养皿内种植7x105的HEK-293T细胞，培养基体积为4ml。第二：转染，在细胞种植16-24小时后进行转染操作，可以按照所在实验室常规转染293T的方法进行转染，也可选用前景科创公司的293Fect（专业转染293细胞的转染试剂），方便快速。第三：细胞过夜培养后，换用新鲜培养基（旧的培养基需要经过10%漂白剂处理后才能丢弃）。24小时后，观察293T细胞，如果细胞状态不好，约有20%-30%的细胞死亡，此时收集培养基（已经有慢病毒产生），置于15ml离心管内（Biologix,货号：10-0151），存放于4oC。否则，可继续等待直至48小时，待细胞状态如上面描述时，收获培养基。第四：收获一次慢病毒后，可继续加入4ml新鲜培养基，24小时后再收获一次病毒。将两次收获的病毒液合并，1250rpm，离心5分钟，将细胞碎屑离心至管底，取上清感染细胞或者冻存。也可用孔径为0.45µm的针头滤器过滤去除293T细胞。病毒液在4oC可以存放几天，如需长期保存，需要分装后冻存于-80℃。四、Rnai慢病毒包装的应用前景神经系统疾病的基因治疗，Lesch-Nyhan综合征是一种遗传性的代谢性脑病，由编码次黄嘌呤核糖转移酶(HPRT)的基因缺陷所引起；帕金森氏病是一种退行性脑病，由于产生多巴的神经元退化，导致大脑纹状体内多巴胺水平降低，临床上给患者注射左旋多巴可改善症状，但长期注射及药物的副作用令患者难以承受。较为理想的方式是在脑内持续表达酪氨酸羟化酶(TH)，使其催化酪氨酸转变为为左旋多巴；Alzheimer氏病也是一种多因素引起的退行性脑病，造成大脑皮质和海马回神经元萎缩，通常采用神经营养因子防止神经元退化。由于慢病毒载体能够体内转导神经元并建立长期稳定的表达，因此对于以上疾病的基因治疗非常具有吸引力。可以设想，分别将编码HPRT、TH或神经营养因子的基因通过慢病毒载体介导，体内注射至神经元，有可能对上述疾病产生良好效果。血液系统疾病的基因治疗，造血干细胞一直被认为是对血液系统恶性肿瘤或其它疾病(如地中海贫血、镰刀性红细胞贫血、血友病等)进行基因治疗的理想靶细胞，但由于缺乏使目的基因在造血干细胞稳定表达的，这方面的研究进展不明显。尽管小鼠逆转录病毒载体能够转导经细胞因子刺激后进入细胞周期的造血干细胞，但经此处理的干细胞性质可能会发生改变。慢病毒载体则可通过直接转导静止的干细胞避免这类。将多药耐药(MDR)基因导入造血干细胞，可使其耐受大剂量化疗，可能成为治疗白血病和其它恶性肿瘤的有效途径；将正常珠蛋白基因或凝血因子Ⅷ、Ⅸ分别导入造血干细胞，有望对地中海贫血、镰刀性红细胞贫血和血友病产生疗效。Rnai慢病毒包装技术服务我们公司提供Rnai慢病毒包装技术服务。如果您有需要可以拨打我们的服务电话021-51262103或发送邮件至邮箱[email protected]来询价，或者登入：www.biovol.net查询！
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