慧德易教您在色谱柱出现故障时的解决方法

  仪器信息网 ·  2012-12-19 12:10  ·  19755 次点击
慧德易教您在色谱柱出现故障时的解决方法
选样了一根好的色谱柱,再加上有效的维护与预防,可以避免不少意外故障的发生。当然谁也不能保护色谱柱“永远”不出故障,任何一根色谱柱最终都会因为柱效下降直到报废。柱损坏的标志是:①塔板数下降;②峰形改变;③压力增加;④保留时间变化。有时往往是几种情况伴随着同时发生。
1、塔板数下降
在色谱柱使用过程中,塔板数会不断下降.一般情况下,进2000个样品后柱效N值要降低50%,(但也不能一概而论),而用C18,柱梯度分析氨基酸,进100个血清样品之后,柱效就下降50%。这两种情况的差别之所以这么大,关键在于处理样品的方法不同。
如果柱效很快下降,应考虑上节所提到的人为不利因素。N值突然下降(如一个工作日内),应考虑柱头塌陷或进了不合格的样品。如果使用了不同系统的色谱柱造成柱效下降,是某系统中存在柱外效应。新建立的方法中柱效下降,可能是样品和其它内在因素引起,此时要采取相应措施,防止继续给柱造成危害。
2、峰形变坏
出现拖尾峰、分叉峰或非高斯峰的原因很多,但总是与塔板数骤然下降联系在一起的。峰形变坏而保留时间不变,多半是柱受到阻塞(不锈钢烧结片),或者柱头有了空穴。
3、压力增加
和柱塔板数不断减少一样,在使用过程中柱压慢慢增加,可视为正常。如果压力一下子增加过高,应考虑两种可能,一是样品沉积在柱内,二是柱内硬件阻塞(未考虑系统其它部分的阻塞)。
对于第一种情况,要用能溶解所用样品的溶剂冲洗。冲洗时拆开柱与检测器之间接头,正向冲洗或将柱出口接在泵上反向冲洗(如果柱条件许可),使用大约30~50mL溶剂。不要让冲洗液通过检测器流动池,以防污染。在冲洗过程中不断检查,直到压力恢复正常为止。如冲洗无效,应该考虑是第二种情况,先换烧结不锈钢过滤片,拆下柱,拧开柱头上的压帽,持垂直方向小心取出不锈钢过滤片,换上新的(不是洗过的旧滤片)。换滤片时尽量不要搅动柱头填料,如有塌陷,可用同种填料中乙醇调成糊状补平柱头,压紧,压平,柱性能可恢复如前。如果柱头填料己脏,可挖去2~3mm,用新填料补平。
4、保留时间的改变
保留时间的变化指两种类型的情况,第一种是同一根柱样品间的保留变化,第二种类型主要是填料的差异造成的,许多实验都会碰到,现讨论如下。
不同牌号的色谱柱分离的色谱峰保留时间可在小范围内移动,但峰的顺序和分辨率不变,可改变流速或溶剂强度(反相色谱加水调节)进行校正。如果谱图中色谱顺序发生了变化,或者两峰重叠在一起,问题就比较严重。保留时间发生大的变化,主要由柱填料硅酸相互作用所致,另外有次级保留因素的影响。硅胶为基质的填料表面含有硅醇,有的封尾填料可部分去掉硅醇、不封尾填料的硅胶表面硅醇基更多。酸性或碱性分子可与硅醇发生不同程度的相互作用。硅酸与样品分子作用的强弱,因不同批号的硅胶和不键合相填料而异。即使同批号的硅胶而不同批号的键合相也有差异。硅醇对阳离子或碱性样品影响最大。参照下列要求做可以减少色谱柱之间保留时间的变化。
(1)仅用同一厂商的色谱柱。实际上不具可操作性,但最起码作某一专门分析方法时要用同一厂商的色谱柱。
(2)设计分离条件,使保留值变化最小(建立标准的方法)。
(3)选用液相色谱系统或色谱柱对次级保留因素(外界)灵敏度最低。
(4)换新柱时调整分析条件保持旧柱的保留值(改变条件)。这一步工作是必不可少的,在长期的常规分析中,不会从头至尾用一根柱,中间总要换新柱,每换一次,都应仔细地调整各组分的保留。
在实际工作中,应考虑到可能会发生什么问题,怎样预防这些问题的发生。
第一,前面提到的作某一专门分析尽量用同一批号的色谱柱。也可与厂商接洽,提出特殊的要求。
第二,选择硅醇影响最小的分离条件,减少柱间的差异。如在流动相中添加三乙胺抑制硅醇的作用。
第三,许多色谱工作者认为,在流动相中加入离子对试剂更能抗硅醇的干扰,使保留具有更好的重复性。
不管什么情况下引起保留值的明显变化,都应该改善分离条件。
改善特别差的峰的分离度,并使保留值稳定下来。例如用梯度洗脱分析体液中的氨基酸,这种复杂的样品有20多个组分,保留稍有变化可能对分离就产生灾难性的结果。一些极端组分,如偏向酸性或碱性的组分很易发生保留值的改变,应用不同流动相的组成、pH值和缓冲液的浓度,可以改善关键色谱峰间的分离。色谱峰分离度变差,可能会系统地改变保留值。
塔板数降低、压力增高、峰形变差、保留值变化可能同时发生,可能都是由色谱柱引起的。下表的内容可帮助找到一些故障的原因,有些内容将在后面的章节中详细讨论。
表11-1由色谱柱引起的故障
故障
现象
解决办法
过滤片阻塞
柱头塌陷
键合相流失
样品阻塞
强吸附的样品
压力增高,N下降,峰形差
峰分叉,N下降
保留改变,峰形差,N下降
高压
N下降,保留减小
倒柱冲洗或换过滤片
修补柱头,可恢复80%以上
换柱
用能溶解样品的溶剂冲洗柱
强溶剂反冲
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